Técnicas de crioconservación
La crioconservación
clásica incluye la deshidratación inducida en condiciones estériles en una
cámara de flujo laminar, el pre-enfriamiento paulatino de los materiales (se
utilizan diferentes gradientes de temperatura, por ejemplo: 10, 8, 4, -20 y -40
°C, así como diferentes tiempos de permanencia en esas temperaturas), la
inmersión en NL sin crioprotectantes y, posteriormente, el almacenamiento a –80
°C. Sin embargo, nuevas técnicas basadas en la eliminación parcial de agua en
los tejidos y el congelamiento inmediato de los explantes han desplazado
parcialmente a la técnica clásica (Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005). Estas
nuevas técnicas son:
(1) vitrificación
(2) encapsulación – deshidratación
(3) encapsulación – vitrificación
(4) precrecimiento
(5) precrecimiento –deshidratación
(6) desecación
(7) enfriamiento de gotas .
La vitrificación es
un proceso que promueve la deshidratación celular y "solidificación"
de líquidos en ausencia de cristalización (se evita la formación de cristales
de hielo intracelulares que dañan los tejidos). Con la "solidificación"
se induce un estado con una estructura molecular aleatoria pero que posee
propiedades físicas y mecánicas similares a un sólido. Esta transición del agua
líquida a una fase amorfa cambia la conformación estructural celular hacia una
apariencia vidriosa (Matsumoto et al. 2001, Dixit et al. 2004, Wang et al.
2005, Benson et al. 2006). La vitrificación es realizada previa al
congelamiento por medio de una sustancia crioprotectante (Matsumoto et al.
2001, Dixit et al. 2004, Wang et al. 2005).
2) Encapsulación – deshidratación
La encapsulación - deshidratación
se ha utilizado con ápices de tallo y tejidos embriogénicos. Los explantes se
precultivan en una solución con concentración alta de sacarosa (0,5-0,75 M) y
luego son encapsulados en alginato de calcio o en polioxietilen glicol (PEG);
después se les aplica una deshidratación en la cámara de flujo laminar (cuatro
a cinco horas), se congelan con NL y se mantienen a -80 °C por el período de
almacenamiento. El descongelamiento se realiza en baño de María a 40 °C por uno
a dos minutos y se cultivan en medio para la recuperación del crecimiento y
regeneración (Ara et al. 2000, Dixit et al. 2004).
(3) Encapsulación – vitrificación
La encapsulación - vitrificación
es similar al anterior en cuanto al uso de alginato de calcio para la
encapsulación. Se diferencia del mismo por no utilizar el precultivo de los
explantes en una solución con alta concentración de sacarosa, sino más bien por
el uso de una solución crioprotectante (como se menciona en la primera técnica)
a 0 °C por unas horas, en su lugar, y por haber sido usado específicamente para
meristemas. Los meristemas son encapsulados en medios que contienen altas
concentraciones de azúcares (glicerol 2 M y/o sacarosa 0,4 M). Se congelan
inmediatamente con NL y se mantie nen a -80 °C (Hi rai y Sa kai 2003, Dixit et
al. 2004). El proceso de descongelamie nto es similar al utilizado en la
técnica de encapsulación– deshidratación.
(4) Precrecimiento
El precrecimiento se ha utilizado
específicamente para embriones cigóticos y somáticos. La técnica involucra el
cultivo in vitro previo de los embriones en presencia de crioprotectantes por
varios días. Posteriormente, los embriones se congelan directamente en NL, para
luego almacenarlos a -80 oC. El proceso de descongelamiento es similar a la
técnica de encapsulación – deshidratación (Engelmann 2000, Dixit et al. 2004).
(5) Precrecimiento –
deshidratación
En el precrecimiento -
deshidratación se utilizan segmentos de tallo previamente cultivados en un
medio alto en sacarosa, ABA o PRO. Posteriormente estos se desecan en flujo de
aire y se congelan directamente en NL.
6) Desecación
La desecación se ha utilizado
sólo con semillas recalcitrantes y estructuras haploides como polen y óvulos.
En ella se realiza primero la desecación de los tejidos o semillas en una
cámara de flujo laminar o en un aparato con aire comprimido estéril o en sílica
gel y, luego se congelan las estructuras con NL (Engelmann 2000, Dixit et al.
2004)
7) Enfriamiento de gotas
En enfriamiento de gotas se ha
realizado con ápices de tallos, los cuales son pretratados con una solución
crioprotectante y luego colocados sobre papel aluminio, de manera que se formen
gotas pequeñas de crioprotectante con el ápice en el centro. Los explantes se
congelan directamente con NL (Dixit et al. 2004).
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