4.2.5 Tecnología de ADN recombinante en la agricultura

h  En nuestro genoma y en el de todos los organismos vivos hay material genético repetido, probablemente de origen bacteriano o viral, llamado “transposones” que representa al menos 30% del genoma humano. En el maíz los transposones constituyen 85% de su genoma. Los transposones son secuencias de DNA que pueden translocar su posición en el genoma, es decir pueden “brincar” de un lugar a otro, inclusive entre cromosomas, por lo que han jugado y siguen jugando un papel importante en la reorganización y evolución del genoma. En el maíz, los granos de colores diferentes en una mazorca son resultado de este tipo de fenómeno que ocurre en un mismo individuo.

•         Se a  modificado genéticamente, a lo largo de cientos de años, las especies que utilizamos para  alimentación, y hasta hace poco sin conocer la estructura del ADN, utilizando mutágenos que se sabe generan múltiples cambios en los genomas de los organismos. Sin embargo, estas técnicas originales de mutagénesis y los organismos generados, no se cuestionan como los transgénicos, cuando en el fondo hoy sabemos que los métodos usados previamente generan cambios mucho más amplios en el genoma de estos organismos. La razón de la falta de cuestionamiento es, probablemente, la ausencia de daño por estos organismos altamente modificados, desde el punto de vista genético.

Riesgos a la biodiversidad por la liberación de organismos  modificados genéticamente

h   Dispersión de polen y semillas de OGM.

h   Hibridación  y flujo de genes entre cultivos modificados genéticamente y los no modificados, así como con los parientes silvestres.

h   Pérdida de germoplasma (variabilidad genética).

h   Potencial de convertirse en malezas

h   Introducción de especies exóticas.

h   Competencia entre especies.

h   Efectos en especies no blanco (interacciones en los ecosistemas).

h   Desarrollo de nuevos virus a partir de virus que contienen los OGM.

4.2.4 Vectores de clonación

  Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. 

Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

• Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Figura a

En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido.  En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

•  

Figura b

En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

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Figura c

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

• Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo(figura f). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

figura d

figura e

figura f

Aquí tienes otro pequeño juego para que construyas tu virus. Tienes dos moléculas de ADN

  Cósmidos . Son plasmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el cssmido uniendo los tres elementos ginicos, y el resultado final es poder introducir en la cilula receptora fragmentos largos de ADN.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. 

• Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
• Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.

En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.

La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En las siguiente animación puede verse el proceso.

Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.

imagen dinamica del proceso 

BIBLIOGRAFÍA 

http://www.arrakis.es/~ibrabida/viginsercion.html

4.2.3 Clonación de genes

Objetivo: Aislamiento y amplificación de un gen de interés para su posterior manipulación genética

Pasos:

1.  Aislamiento y fragmentación de la fuente de ADN: ADNg (genómico), ADNc

(copia), producto de PCR.

2.  Inserción del fragmento de ADN en un vector de clonado.

3.  Introducción y amplificación del vector recombinante en un organismo huésped.

Es el proceso mediante el cual puede aislarse un gen de entre todos los genes diferentes que existen en un organismo, lo que permite realizar su caracterización. Esto se consigue con la preparación de una batería de bacterias que contienen todos los genes distintos presentes en un organismo de manera que cada una de ellas contiene un solo gen. Esto se lleva a cabo efectuando cortes del ADN de un individuo. Otra alternativa es la de crear un conjunto de todas las secuencias de ADN expresadas en una célula específica mediante la producción de copias complementarias de ADN a partir del ARNm hallado en dichas células (v ase Biología molecular). En ambos casos, los fragmentos de ADN se unen a un vector, un virus bacteriano conocido como bacteriófago o a un ADN circular denominado plasmido, que se introduce en una bacteria de forma que cada una adquiere solo una copia del vector y por tanto recibe solo un fragmento de ADN.

El primer mamífero que se logró clonar fue una oveja. Los núcleos donantes, en este caso, provenían de un estado inicial del desarrollo del embrión (cuando la mórula, que así se llama a esta fase, tenía sólo unas 8-16 células). Fue Wilmut y su equipo del Instituto de Edimburgo el que logró clonar la primera oveja. El artículo salió en Nature el año pasado. Pero, Wilmut y sus colaboradores han guardado un as en la manga desde el pasado julio: el estudio del Nature de hoy muestra por primera vez que se pueden obtener animales clónicos con el mismo procedimiento que hasta ahora pero a partir de núcleos de embriones más maduros. Y, lo más importante, es que una de las ovejas producidas por su experimento -la estrella, Dolly- procede de una línea celular que cogió su fuente de material genético a partir de las células de la glándula mamaria de una oveja de seis años de edad.

BIBLIOGRAFÏA

http://html.rincondelvago.com/clonacion_3.html

http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=5&sqi=2&ved=0CEEQFjAE&url=http%3A%2F%2Fwww.iib.org.ar%2Fbajar_material.php%3Farchivo%3D49.pdf&ei=1tC-UOGrPMLcqwHd2ICoAg&usg=AFQjCNFnT263VmF7zJIShoX3_F-SuQQh2g&sig2=mAZloxNDRwrAtbTCLtjYrQ

4.2.2 Enzimas de unión

 Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras. 

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma.                   Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación. 

4.2 Corte y unión de moléculas de ADN ; 4.2.1 Enzimas de corte

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos.

Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción	Organismo de donde se extrae
EcoRI	Escherichia coli
EcoRII	Escherichia coli
HindII	Haemophilus influenzae
HindII	Haemophilus influenzae
HaeIII	Haemophilus aegyptius
HpaII	Haemophilus parainfluenzae
PstI	Providencia stuartii
Mayi	Serratia marcesens
BamI	Bacillus amyloliquefaciens
BglII	Bacillus globiggi

Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:

(1) corte con extremos cohesivos y

(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et al. 1998). 

Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados.

De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos:

-las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombínate.

-Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión.

-Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.

4.1 Transformación de organismos

La recombinación genética es un proceso biológico que se produce normalmente en todos los organismos, tras el cual se produce un cambio del genoma (patrimonio genético del que está dotado un organismo) y se verifica normalmente con la rotura y la reunión del ADN. 

Hoy es posible crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de restricción y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e inserirla en el ADN de otro. Las formas vivas que han sufrido tal transformación y que contienen un ADN extraño son llamadas transgénicas. Es quizás necesario abrir un paréntesis para aclarar el hecho de que la clonación de la oveja Dolly no se ha obtenido con técnicas de ingeniería genética. Dolly es solamente un gemelo idéntico, como los que se observan en la naturaleza, aunque estos últimos son "más" idénticos en cuanto que comparten también el material genético contenido en las mitocondrias.

Las técnicas de clonación que permiten obtener gemelos idénticos consisten en sustituir el núcleo de la célula madre por un núcleo de un donante del cual se quiere hacer una copia. La célula obtenida de este modo dará origen a un embrión cuyas mitocondrias contendrán el ADN de la célula madre y no el contenido en las mitocondrias del organismo del cual se ha querido hacer la copia. En caso de gemelos idénticos obtenidos naturalmente, los dos individuos comparten todo el patrimonio genético incluido el mitocondrial. Cerrado este paréntesis necesario para subrayar la diferencia entre ingeniería genética y clonación, en la que no se manipula el ADN y no se interviene en el orden genético de los organismos, pasamos a describir los vectores moleculares necesarios para las operaciones de ingeniería genética.


BIBLIOGRAFÍA 

http://www.ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html

UNIDAD IV: ADN RECOMBINANTE