4.2.5.2 Animales transgénicos

Los animales transgénicos son aquellos que poseen un gen que no les pertenece La forma más sencilla para generar un animal transgénico es la que involucra el aislamiento del gen que se quiere introducir (al que llamaremos transgén), su clonación y manipulación para que pueda ser expresado por el organismo blanco, y su inserción en el organismo. Para lograr que todas las células del organismo expresen este nuevo gen, incorporamos dicho gen en un embrión en estadio de cigoto. Una vez seguros que el embrión incorporó el transgén, implantamos el embrión en un animal receptivo, que actúa como madre (en un procedimiento similar al de fertilización in vitro).

MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS: ANTECEDENTES Y CRONOLOGÍA
1938:
Spemann propone experimento de transferencia nuclear
1949:
Hammond mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro
1961:
Tarkowski obtiene ratones quiméricos agregando embriones
1966:
Lin describe la técnica de microinyección de embriones de ratón
1980:
Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981
Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981:
Evans y Kaufman obtienen células embrionarias totipotentes de ratón
1982:
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona del crecimiento de la rata
1983
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona de crecimiento humana
1983:
McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para experimentos de transferencia nuclear en ratón
1985:
Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos (conejos, ovejas, cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano
1987:
Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout por recombinación homóloga
1989
Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano del factor IX de coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto
1991
Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano de la a -1-antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1991
Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH humano (activador tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADN en pronúcleo de cigoto
1991
Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen humano de la lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1993:
Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo de embriones
1993:
Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con cromosomas artificiales de levaduras
1994:
Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por transplante de espermatogonias
1996:
Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células embrionarias en cultivo
1997:
Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1997:
Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1998:
Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1999
Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por transferencia nuclear
1999
Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante la co-inyección de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
1. TÉCNICAS DE OBTENCIÓN
Las técnicas de obtención de animales transgénicos son:

·        Microinyección de ADN en núcleo de ovocito

·        Microinyección de ADN en pronúcleo o en citoplasma de cigoto (óvulo fecundado)

·        Electroporación de cigoto

·        Transfección de células totipotentes

·        Co-inyección en ovocitos de una mezcla de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno

·        Vectores virales

·        Transfección de gametos

·        Transferencia de núcleos transfectados (clonación)

·        4149.- Técnica de obtención de ratones transgénicos mediante microinyección de ADN en el pronúcleo masculino de un cigoto obtenido por fecundación in vitro (Fuente: H. Lodish et al., 1995, Molecular and Cell Biology, Scientific American Books)

PROBLEMAS DE LA TRANSGÉNESIS
La introducción de una nueva información genética (el transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentar algunos problemas en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal como se indica a continuación:

·        Integración múltiple (en tándem o no)

·        Lugar de integración indeterminado (efecto de posición)

·        Metilación y falta de expresión

·        Mosaicismo (germinal y somático)

·        Expresión específica/ectópica

·        Expresión variable

·        Expresión variable dentro de líneas (variegación)

En cualquier caso, el ideal sería poder dirigir con total precisión el lugar de integración del transgén. Así, por ejemplo, en 1999 se obtuvieron en el Roslin Institute de Edinburgo las ovejas transgénicas "Cupid" y "Diana" a partir de la clonación de cultivos celulares modificados mediante recombinación homóloga ("gene targeting").

Cabras transgénicas portadoras de un gen humano. La técnica para producir un animal transgénico consta de varios pasos: a) se produce un transgén, b) se realiza una fertilización in vitro, c) se inyecta el gen transgénico en el cigoto, d) se implanta el embrión en una madre sustituta. De esta manera se han producido conejos, cabras, ovejas y chanchos transgénicos.

Vacas transgénicas
La gran producción lechera de las vacas (10.000 litros/año, 35 g proteína/litro de leche) las convierte en poderosos biorreactores de proteínas humanas. En 1991, tres grupos de investigación de Holanda (la Universidad de Leiden, la empresa Gene Pharming Europe y el Instituto de Producción Animal de Zeist) obtuvieron vacas transgénicas portadoras del gen humano de la lactoferrina que se sintetizaba en la leche del animal por estar unido al promotor de la a -S1-caseína bovina. Así, Krimpenfort et al. (1991) inyectaron 1.154 pronúcleos de otros tantos cigotos obtenidos por fecundación in vitro, de los cuales sobrevivieron 981.
A los 9 días transfirieron 129 embriones a vacas estimuladas hormonalmente (pseudopreñez), quedando 21 de ellas preñadas y sólo 16 llevaron a término la gestación. Se obtuvo un macho y una hembra (que era un mosaico). El macho dio positivo para la presencia del gen humano en todos los tejidos analizados (placenta, oreja y sangre), estimándose que era portador de 5 a 10 copias del gen humano.
Más tarde, otro grupo de investigación (Cibelli et al., 1998) obtuvo tres terneros clónicos transgénicos que llevaban el trasgén híbrido b -gal-neo que se expresaba con un promotor muy potente del citomegalovirus.
En el caso de las vacas, otros objetivos pueden ser la aplicación de la técnica conocida como "modelo de la glándula mamaria" para reducir la lactosa (para los casos de intolerancia) o fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la técnica de "knockout" del gen de la b -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.
XENOTRASPLANTES
Desde que el Doctor Christiaan Barnard hiciera su primer trasplante de corazón, la técnica de trasplante de órganos se ha generalizado en la práctica médica, habiendo alcanzado altísimos niveles de perfección. Sin embargo, uno de los retos pendientes es el de la oferta y la demanda: desgraciadamente muchos pacientes mueren antes de tener acceso al trasplante deseado. Por ello la posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de órganos se planteó hace ya muchos años. De hecho, entre los años 1964 y 1995 se han realizado 32 xenotrasplantes de riñón, corazón, hígado y médula ósea procedentes mayoritariamente de chimpancé y mandril con un resultado negativo en todos los casos, tal como se indica en el cuadro adjunto:
La utilización de órganos procedentes de monos tenía la lógica de su proximidad evolutiva con la especie humana, pero la diferencia de tamaños de los órganos entre las especies suponía un serio inconveniente. Por eso se pensó en el cerdo como posible donante. Por otro lado, una causa importante del fracaso de los xenotrasplantes es el rechazo hiperagudo que se produce cuando el organismo humano reconoce la presencia del órgano de otra especie. De ahí surgió la idea de utilizar cerdos transgénicos como posibles donantes.

Respecto a la utilización de cerdos transgénicos como reservorio de órganos para posibles trasplantes (xenotrasplantes) de corazón, riñón o hígado a pacientes humanos hay que ser todavía muy cauto en relación con las expectativas creadas.