4.4 Bioética y revolución biotecnológica

En un contexto bioético quizá podría ser conveniente hacer una valoración general sobre lo que significa la introducción de genes humanos en organismos no humanos. Habría que distinguir dos situaciones diferentes: la primera, cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace en beneficio del propio hombre, y la segunda cuando la transferencia del gen humano al organismo no humano se hace exclusivamente en beneficio (o perjuicio) de este último.
Desde el punto de vista bioético, la situación creada por la obtención de mamíferos transgénicos portadores de genes humanos para la obtención de proteínas terapéuticas humanas no es esencialmente nueva ya que, desde los primeros tiempos de la ingeniería genética molecular, se han introducido genes humanos en células bacterianas para obtener proteínas humanas (insulina, hormona de crecimiento, interferón, etc.). Tanto en el caso de las bacterias como de los animales transgénicos que se convierten en factorías naturales (biorreactores) de proteínas humanas, la valoración ética es positiva. En este último caso es importante señalar además que, al quedar restringida la expresión del gen humano a las células de la glándula mamaria, la fisiología y desarrollo del animal no se ven alterados y por tanto se evita cualquier daño a éste, quedando protegidos así los derechos de los animales.
En el segundo caso planteado, cuando la transferencia del transgén humano se realiza con el único propósito de influir en el desarrollo del animal, la valoración ética puede ser negativa si se producen anomalías importantes en su fisiología, como ocurrió en los cerdos que habían incorporado el gen humano de la hormona del crecimiento. Finalmente, en este contexto ¿podría decirse que algún gen humano concreto - en definitiva, un trozo de ADN - merecería un tratamiento o 

4.3 Legislación

Ley de Bioseguridad de Organismos Genéticamente Modificados

TÍTULO PRIMERO Disposiciones Generales

CAPÍTULO I Objeto y Finalidades

ARTÍCULO 1.- La presente Ley es de orden público y de interés social, y tiene por objeto regular las actividades de utilización confinada, liberación experimental, liberación en programa piloto, liberación comercial, comercialización, importación y exportación de organismos genéticamente modificados, con el fin de prevenir, evitar o reducir los posibles riesgos que estas actividades pudieran ocasionar a la salud humana o al medio ambiente y a la diversidad biológica o a la sanidad animal, vegetal y acuícola.

ARTÍCULO 2.- Para cumplir su objeto, este ordenamiento tiene como finalidades:

I. Garantizar un nivel adecuado y eficiente de protección de la salud humana, del medio ambiente y la diversidad biológica y de la sanidad animal, vegetal y acuícola, respecto de los efectos adversos que pudiera causarles la realización de actividades con organismos genéticamente modificados;

II. Definir los principios y la política nacional en materia de bioseguridad de los OGMs y los instrumentos para su aplicación;

III. Determinar las competencias de las diversas dependencias de la Administración Pública Federal en materia de bioseguridad de los OGMs;

IV. Establecer las bases para la celebración de convenios o acuerdos de coordinación entre la Federación, por conducto de las Secretarías competentes y los gobiernos de las entidades federativas, para el mejor cumplimiento del objeto de esta Ley;

V. Establecer las bases para el funcionamiento de la Comisión Intersecretarial de Bioseguridad de los Organismos Genéticamente Modificados, a través de la cual las Secretarías que la integran deban colaborar de manera coordinada, en el ámbito de sus competencias, en lo relativo a la bioseguridad de los organismos genéticamente modificados;

VI. Establecer procedimientos administrativos y criterios para la evaluación y el monitoreo de los posibles riesgos que puedan ocasionar las actividades con organismos genéticamente modificados en la salud humana o en el medio ambiente y la diversidad biológica o en la sanidad animal, vegetal o acuícola;

VII. Establecer el régimen de permisos para la realización de actividades de liberación experimental, de liberación en programa piloto y de liberación comercial, de organismos genéticamente modificados, incluyendo la importación de esos organismos para llevar a cabo dichas actividades;

VIII. Establecer el régimen de avisos para la realización de actividades de utilización confinada de organismos genéticamente modificados, en los casos a que se refiere esta Ley;

IX. Establecer el régimen de las autorizaciones de la Secretaría de Salud de organismos genéticamente modificados que se determinan en esta Ley;

X. Crear y desarrollar el Sistema Nacional de Información sobre Bioseguridad y el Registro Nacional de Bioseguridad de los Organismos Genéticamente Modificados;

XI. Determinar las bases para el establecimiento caso por caso de áreas geográficas libres de OGMs en las que se prohíba y aquellas en las que se restrinja la realización de actividades con determinados organismos genéticamente modificados, así como de cultivos de los cuales México sea centro de origen, en especial del maíz, que mantendrá un régimen de protección especial;

XII. Establecer las bases del contenido de las normas oficiales mexicanas en materia de bioseguridad;

XIII. Establecer medidas de control para garantizar la bioseguridad, así como las sanciones correspondientes en los casos de incumplimiento o violación a las disposiciones de esta Ley, sus reglamentos y las normas oficiales mexicanas que deriven de la misma;

XIV. Establecer mecanismos para la participación pública en aspectos de bioseguridad materia de esta Ley, incluyendo el acceso a la información, la participación de los sectores privado, social y productivo a través del Consejo Consultivo Mixto de la CIBIOGEM, y la consulta pública sobre solicitudes de liberación de OGMs al ambiente, y

XV. Establecer instrumentos de fomento a la investigación científica y tecnológica en bioseguridad y biotecnología.

ARTÍCULO 3.- Para los efectos de esta Ley, se entiende por:

I. Accidente: La liberación involuntaria de organismos genéticamente modificados durante su utilización y que pueda suponer, con base en criterios técnicos, posibles riesgos para la salud humana o para el medio ambiente y la diversidad biológica.

II. Actividades: La utilización confinada, la liberación experimental, la liberación en programa piloto, la liberación comercial, la comercialización, la importación y la exportación de organismos genéticamente modificados, conforme a esta Ley.

4.2.5.2 Animales transgénicos

Los animales transgénicos son aquellos que poseen un gen que no les pertenece La forma más sencilla para generar un animal transgénico es la que involucra el aislamiento del gen que se quiere introducir (al que llamaremos transgén), su clonación y manipulación para que pueda ser expresado por el organismo blanco, y su inserción en el organismo. Para lograr que todas las células del organismo expresen este nuevo gen, incorporamos dicho gen en un embrión en estadio de cigoto. Una vez seguros que el embrión incorporó el transgén, implantamos el embrión en un animal receptivo, que actúa como madre (en un procedimiento similar al de fertilización in vitro).

MAMÍFEROS TRANSGÉNICOS: ANTECEDENTES Y CRONOLOGÍA
1938:
Spemann propone experimento de transferencia nuclear
1949:
Hammond mantiene embriones de ratón en cultivo in vitro
1961:
Tarkowski obtiene ratones quiméricos agregando embriones
1966:
Lin describe la técnica de microinyección de embriones de ratón
1980:
Gordon, Ruddle y col. obtienen los primeros ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981
Gordon y Ruddle obtienen ratones transgénicos por microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos de ratón
1981:
Evans y Kaufman obtienen células embrionarias totipotentes de ratón
1982:
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona del crecimiento de la rata
1983
Palmiter y col. obtienen ratones transgénicos gigantes mediante transgenes de la hormona de crecimiento humana
1983:
McGrath y Solter desarrollan una nueva técnica para experimentos de transferencia nuclear en ratón
1985:
Hammer y col. obtienen animales de granja transgénicos (conejos, ovejas, cerdos) con el transgén de la hormona del crecimiento humano
1987:
Thomas y Capecchi obtienen los primeros ratones knockout por recombinación homóloga
1989
Clark y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano del factor IX de coagulación de la sangre mediante microinyección de ADN en el pronúcleo del cigoto
1991
Wright y col. obtienen ovejas transgénicas con el gen humano de la a -1-antitripsina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1991
Ebert y col. obtienen cabras transgénicas con el gen AtPH humano (activador tisular de plasminógeno) mediante microinyección de ADN en pronúcleo de cigoto
1991
Krimpenfort y col. obtienen vacas transgénicas con el gen humano de la lactoferrina mediante microinyección de ADN en el pronúcleo de cigotos
1993:
Nagy y Rossant obtienen ratones quiméricos por co-cultivo de embriones
1993:
Schedl y col. obtienen ratones transgénicos con cromosomas artificiales de levaduras
1994:
Brinster y col. obtienen ratones transgénicos por transplante de espermatogonias
1996:
Campbell y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células embrionarias en cultivo
1997:
Wilmut y col. obtienen ovejas clónicas por transferencia nuclear de células diferenciadas fetales y adultas en cultivo
1997:
Schnieke y col. obtienen ovejas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1998:
Cibelli y col. obtienen vacas clónicas transgénicas por transferencia nuclear a partir de células fetales diferenciadas
1999
Baguisi y col. obtienen cabras transgénicas por transferencia nuclear
1999
Yanagimachi y col. obtienen ratones transgénicos mediante la co-inyección de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno
1. TÉCNICAS DE OBTENCIÓN
Las técnicas de obtención de animales transgénicos son:

·        Microinyección de ADN en núcleo de ovocito

·        Microinyección de ADN en pronúcleo o en citoplasma de cigoto (óvulo fecundado)

·        Electroporación de cigoto

·        Transfección de células totipotentes

·        Co-inyección en ovocitos de una mezcla de cabezas de espermatozoides y ADN exógeno

·        Vectores virales

·        Transfección de gametos

·        Transferencia de núcleos transfectados (clonación)

·        4149.- Técnica de obtención de ratones transgénicos mediante microinyección de ADN en el pronúcleo masculino de un cigoto obtenido por fecundación in vitro (Fuente: H. Lodish et al., 1995, Molecular and Cell Biology, Scientific American Books)

PROBLEMAS DE LA TRANSGÉNESIS
La introducción de una nueva información genética (el transgén) dentro del genoma de un organismo puede presentar algunos problemas en relación a dónde y cuándo expresar el transgén, tal como se indica a continuación:

·        Integración múltiple (en tándem o no)

·        Lugar de integración indeterminado (efecto de posición)

·        Metilación y falta de expresión

·        Mosaicismo (germinal y somático)

·        Expresión específica/ectópica

·        Expresión variable

·        Expresión variable dentro de líneas (variegación)

En cualquier caso, el ideal sería poder dirigir con total precisión el lugar de integración del transgén. Así, por ejemplo, en 1999 se obtuvieron en el Roslin Institute de Edinburgo las ovejas transgénicas "Cupid" y "Diana" a partir de la clonación de cultivos celulares modificados mediante recombinación homóloga ("gene targeting").

Cabras transgénicas portadoras de un gen humano. La técnica para producir un animal transgénico consta de varios pasos: a) se produce un transgén, b) se realiza una fertilización in vitro, c) se inyecta el gen transgénico en el cigoto, d) se implanta el embrión en una madre sustituta. De esta manera se han producido conejos, cabras, ovejas y chanchos transgénicos.

Vacas transgénicas
La gran producción lechera de las vacas (10.000 litros/año, 35 g proteína/litro de leche) las convierte en poderosos biorreactores de proteínas humanas. En 1991, tres grupos de investigación de Holanda (la Universidad de Leiden, la empresa Gene Pharming Europe y el Instituto de Producción Animal de Zeist) obtuvieron vacas transgénicas portadoras del gen humano de la lactoferrina que se sintetizaba en la leche del animal por estar unido al promotor de la a -S1-caseína bovina. Así, Krimpenfort et al. (1991) inyectaron 1.154 pronúcleos de otros tantos cigotos obtenidos por fecundación in vitro, de los cuales sobrevivieron 981.
A los 9 días transfirieron 129 embriones a vacas estimuladas hormonalmente (pseudopreñez), quedando 21 de ellas preñadas y sólo 16 llevaron a término la gestación. Se obtuvo un macho y una hembra (que era un mosaico). El macho dio positivo para la presencia del gen humano en todos los tejidos analizados (placenta, oreja y sangre), estimándose que era portador de 5 a 10 copias del gen humano.
Más tarde, otro grupo de investigación (Cibelli et al., 1998) obtuvo tres terneros clónicos transgénicos que llevaban el trasgén híbrido b -gal-neo que se expresaba con un promotor muy potente del citomegalovirus.
En el caso de las vacas, otros objetivos pueden ser la aplicación de la técnica conocida como "modelo de la glándula mamaria" para reducir la lactosa (para los casos de intolerancia) o fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la técnica de "knockout" del gen de la b -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.
XENOTRASPLANTES
Desde que el Doctor Christiaan Barnard hiciera su primer trasplante de corazón, la técnica de trasplante de órganos se ha generalizado en la práctica médica, habiendo alcanzado altísimos niveles de perfección. Sin embargo, uno de los retos pendientes es el de la oferta y la demanda: desgraciadamente muchos pacientes mueren antes de tener acceso al trasplante deseado. Por ello la posibilidad de recurrir a especies animales como donantes de órganos se planteó hace ya muchos años. De hecho, entre los años 1964 y 1995 se han realizado 32 xenotrasplantes de riñón, corazón, hígado y médula ósea procedentes mayoritariamente de chimpancé y mandril con un resultado negativo en todos los casos, tal como se indica en el cuadro adjunto:
La utilización de órganos procedentes de monos tenía la lógica de su proximidad evolutiva con la especie humana, pero la diferencia de tamaños de los órganos entre las especies suponía un serio inconveniente. Por eso se pensó en el cerdo como posible donante. Por otro lado, una causa importante del fracaso de los xenotrasplantes es el rechazo hiperagudo que se produce cuando el organismo humano reconoce la presencia del órgano de otra especie. De ahí surgió la idea de utilizar cerdos transgénicos como posibles donantes.

Respecto a la utilización de cerdos transgénicos como reservorio de órganos para posibles trasplantes (xenotrasplantes) de corazón, riñón o hígado a pacientes humanos hay que ser todavía muy cauto en relación con las expectativas creadas. 

4.2.5.1 Plantas transgénicas

   La planta transgénica contiene uno o más genes que han sido insertados en forma artificial en lugar de que la planta los adquiera mediante la polinización. La secuencia génica insertada (llamada el transgen) puede provenir de otra planta no emparentada o de una especie por completo diferente: por ejemplo, el maíz Bt, que produce su propio insecticida, contiene un gen de una bacteria. Las plantas que tienen transgenes a menudo son llamadas genéticamente modificadas o cultivos GM, si bien en realidad todos los cultivos han sido genéticamente modificados con respecto a su estado silvestre original mediante la domesticación, la selección y el mejoramiento controlado a través de períodos prolongados. En este sitio de la red usaremos el término transgénico para describir una planta de cultivo que tiene transgenes insertados.

                          

Mejora de productos agrarios

• Para el incremento de la producción de las cosechas y la disminución del uso herbicidas
• Beneficiados los agricultores y la sociedad
• Objetivos: obtención de productos con menos contaminantes agroquímicos y de mejor calidad
• Mejorar en el tamaño, valor nutritivo, extensión de vida

•   Resistencia a plagas y enfermedades
•         Resistencia a condiciones ambientales extremas  
•         Integración planta y microorganismos 
•         Las plantas como biofactorías
•        Mejora de la calidad en productos agrarios
•        Plantas tolerantes a herbicidas, virus, insectos

BIBLIOGRAFÍA 

http://cls.casa.colostate.edu/cultivostransgenicos/sp_what.html

4.2.5 Tecnología de ADN recombinante en la agricultura

h  En nuestro genoma y en el de todos los organismos vivos hay material genético repetido, probablemente de origen bacteriano o viral, llamado “transposones” que representa al menos 30% del genoma humano. En el maíz los transposones constituyen 85% de su genoma. Los transposones son secuencias de DNA que pueden translocar su posición en el genoma, es decir pueden “brincar” de un lugar a otro, inclusive entre cromosomas, por lo que han jugado y siguen jugando un papel importante en la reorganización y evolución del genoma. En el maíz, los granos de colores diferentes en una mazorca son resultado de este tipo de fenómeno que ocurre en un mismo individuo.

•         Se a  modificado genéticamente, a lo largo de cientos de años, las especies que utilizamos para  alimentación, y hasta hace poco sin conocer la estructura del ADN, utilizando mutágenos que se sabe generan múltiples cambios en los genomas de los organismos. Sin embargo, estas técnicas originales de mutagénesis y los organismos generados, no se cuestionan como los transgénicos, cuando en el fondo hoy sabemos que los métodos usados previamente generan cambios mucho más amplios en el genoma de estos organismos. La razón de la falta de cuestionamiento es, probablemente, la ausencia de daño por estos organismos altamente modificados, desde el punto de vista genético.

Riesgos a la biodiversidad por la liberación de organismos  modificados genéticamente

h   Dispersión de polen y semillas de OGM.

h   Hibridación  y flujo de genes entre cultivos modificados genéticamente y los no modificados, así como con los parientes silvestres.

h   Pérdida de germoplasma (variabilidad genética).

h   Potencial de convertirse en malezas

h   Introducción de especies exóticas.

h   Competencia entre especies.

h   Efectos en especies no blanco (interacciones en los ecosistemas).

h   Desarrollo de nuevos virus a partir de virus que contienen los OGM.

4.2.4 Vectores de clonación

  Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras. 

Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras.

• Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma. Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación.

Figura a

En esta secuencia de dibujos se puede ver como se realiza la inserción de un gen en un plásmido.  En la figura a tenemos un gen(color rojo) que interesa insertar en un plásmido (color turquesa)

•  

Figura b

En la figura b, vemos como una enzima de restricción ha cortado el gen y el plásmido, quedando unos bordes cohesivos o pegajosos.

•  

Figura c

La unión del ADN que contiene el gen que se desea clonar con el vector de clonación, se realiza por medio de otras enzimas, denominadas ADN-ligasas, que unen ambos trozos de ADN. El resultado es una molécula de ADN recombinante, ya que contiene fragmentos de ADN de distinta procedencia.

• Bacteriófagos. El proceso es similar, se trata de insertar el gen deseado en un fragmento de ADN vírico (figura d) Posteriormente se ensamblarán las distintas partes del virus (figura e). Así quedará el virus completo(figura f). En el siguiente paso se insertará este ADN por el proceso de la TRANSDUCCIÓN.

figura d

figura e

figura f

Aquí tienes otro pequeño juego para que construyas tu virus. Tienes dos moléculas de ADN

  Cósmidos . Son plasmidos que contienen el fragmento de ADN deseado que posee un borde cohesivo procedente del genoma del fago lambda (extremo cos)y se empaqueta en el interior de un fago. Se construye el cssmido uniendo los tres elementos ginicos, y el resultado final es poder introducir en la cilula receptora fragmentos largos de ADN.

Además del origen de replicación, los vectores de clonación deben llevar otros genes denominados marcadores, que sirven para identificar las células que contienen el vector de clonación. Se suelen utilizar como marcadores, genes de resistencia a antibióticos y genes de bioluminiscencia. 

• Genes de resistencia a antibióticos. Sirven para identificar bacterias que contienen el vector de clonación, porque estas bacterias serán resistentes al antibiótico del gen marcador.
• Genes de luminiscencia.. En este caso, la célula que contenga el gen que se quiere clonar, tendrá la propiedad de emitir luz, ya que el marcador que se le incorpora determina que se exprese esa característica. Este sistema se emplea cuando la célula hospedadora es una célula eucariota.

Métodos de introducción del vector. El siguiente paso será introducir el vector de clonación que contiene el gen que se quiere clonar en la célula hospedadora, para que ésta, al multiplicarse, origine un clon celular que lleve el gen concreto.

Existen varios métodos que dependerán del tipo de célula fundamentalmente.

En bacterias (células procariotas), mediante estos procesos:

Transformación. Ocurre espontáneamente en ciertos tipos de bacterias y se consigue artificialmente sometiendo a la célula bacteriana a tratamientos físicos y químicos.

La célula capta moléculas de ADN que se encuentran en el medio externo, las introduce en su interior y las incorpora a su genoma. En las siguiente animación puede verse el proceso.

Transducción. Este método consiste en introducir el ADN en la célula hospedadora mediante un virus, utilizando como vector de clonación el genoma del virus.

En la siguiente figura puede verse el proceso en tres etapas. El número 1 corresponde al virus aproximándose a una bacteria. Se puede observar como lleva un genoma ya con el gen que interesa clonar. El siguiente momento 2, corresponde al contacto entre el virus y la pared bacteriana, en cuya zona de contacto se produce un poro por donde como vemos en la etapa 3, el virus inyecta su ADN al interior de la célula bacteriana.

imagen dinamica del proceso 

BIBLIOGRAFÍA 

http://www.arrakis.es/~ibrabida/viginsercion.html

4.2.3 Clonación de genes

Objetivo: Aislamiento y amplificación de un gen de interés para su posterior manipulación genética

Pasos:

1.  Aislamiento y fragmentación de la fuente de ADN: ADNg (genómico), ADNc

(copia), producto de PCR.

2.  Inserción del fragmento de ADN en un vector de clonado.

3.  Introducción y amplificación del vector recombinante en un organismo huésped.

Es el proceso mediante el cual puede aislarse un gen de entre todos los genes diferentes que existen en un organismo, lo que permite realizar su caracterización. Esto se consigue con la preparación de una batería de bacterias que contienen todos los genes distintos presentes en un organismo de manera que cada una de ellas contiene un solo gen. Esto se lleva a cabo efectuando cortes del ADN de un individuo. Otra alternativa es la de crear un conjunto de todas las secuencias de ADN expresadas en una célula específica mediante la producción de copias complementarias de ADN a partir del ARNm hallado en dichas células (v ase Biología molecular). En ambos casos, los fragmentos de ADN se unen a un vector, un virus bacteriano conocido como bacteriófago o a un ADN circular denominado plasmido, que se introduce en una bacteria de forma que cada una adquiere solo una copia del vector y por tanto recibe solo un fragmento de ADN.

El primer mamífero que se logró clonar fue una oveja. Los núcleos donantes, en este caso, provenían de un estado inicial del desarrollo del embrión (cuando la mórula, que así se llama a esta fase, tenía sólo unas 8-16 células). Fue Wilmut y su equipo del Instituto de Edimburgo el que logró clonar la primera oveja. El artículo salió en Nature el año pasado. Pero, Wilmut y sus colaboradores han guardado un as en la manga desde el pasado julio: el estudio del Nature de hoy muestra por primera vez que se pueden obtener animales clónicos con el mismo procedimiento que hasta ahora pero a partir de núcleos de embriones más maduros. Y, lo más importante, es que una de las ovejas producidas por su experimento -la estrella, Dolly- procede de una línea celular que cogió su fuente de material genético a partir de las células de la glándula mamaria de una oveja de seis años de edad.

BIBLIOGRAFÏA

http://html.rincondelvago.com/clonacion_3.html

http://www.google.com.mx/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=5&sqi=2&ved=0CEEQFjAE&url=http%3A%2F%2Fwww.iib.org.ar%2Fbajar_material.php%3Farchivo%3D49.pdf&ei=1tC-UOGrPMLcqwHd2ICoAg&usg=AFQjCNFnT263VmF7zJIShoX3_F-SuQQh2g&sig2=mAZloxNDRwrAtbTCLtjYrQ

4.2.2 Enzimas de unión

 Inserción de los fragmentos de ADN. Esta inserción se realiza en vectores de clonado, que son los agentes transportadores capaces de introducirlos en las células hospedadoras.
Los vectores de clonación son pequeñas moléculas de ADN, que tienen capacidad para autorreplicarse dentro de las células hospedadoras.
Se utilizan con frecuencia dos tipos de vectores de clonación: plásmidos y virus. de introducirlos en las células hospedadoras. 

Plásmidos. Son moléculas de ADN circular, con un tamaño menor que el del cromosoma.                   Se replican con independencia del cromosoma bacteriano ya que tienen su propio origen de replicación. 

4.2 Corte y unión de moléculas de ADN ; 4.2.1 Enzimas de corte

Enzimas de restricción: producción de fragmentos de DNA para recombinación
Las enzimas de restricción o endonucleasas de restricción fueron descubiertas por Werner Aber, Hamilton Smith y Daniel Nathans. Estas son enzimas sumamente específicas que catalizan la hidrólisis de los enlaces fosfodiéster de los ácidos nucleicos y son capaces de cortar ambas hebras del DNA en lugares específicos, creando de esta manera una serie de fragmentos.

Tabla. Algunas de las principales enzimas de restricción conocidas y su origen (en base a Griffiths et al. 1998).

Enzima de restricción	Organismo de donde se extrae
EcoRI	Escherichia coli
EcoRII	Escherichia coli
HindII	Haemophilus influenzae
HindII	Haemophilus influenzae
HaeIII	Haemophilus aegyptius
HpaII	Haemophilus parainfluenzae
PstI	Providencia stuartii
Mayi	Serratia marcesens
BamI	Bacillus amyloliquefaciens
BglII	Bacillus globiggi

Las enzimas de restricción trabajan únicamente sobre secuencias específicas de bases nitrogenadas, el lugar donde se produce el corte se denomina sitio de restricción y producen dos tipos de corte:

(1) corte con extremos cohesivos y

(2) corte con extremos romos (ver Fig. ) (Griffiths et al. 1998). 

Los extremos cohesivos dejan porciones lineales a ambos lados del fragmento, es decir, quedan pequeñas secuencias de bases sin aparear a cada lado, siendo éstas complementarias entre sí, mientras que los extremos romos son aquellos en los que no queda una porción lineal a ninguno de los lados.

De acuerdo a la especificidad de las enzimas de restricción, se conocen dos tipos:

-las enzimas de tipo I cortan en un sitio cercano al sitio de restricción, a una distancia que varía aleatoriamente, y por ello no se suelen emplear para DNA recombínate.

-Las de tipo II reconocen y cortan en la secuencia específica, y son las más empleadas en este tipo de protocolos por su alta precisión.

-Las enzimas de restricción de tipo III son similares a las de tipo II en cuanto a la precisión del lugar de corte, pero se diferencian de éstas en que sólo cortan entre nucleótidos del mismo tipo, por ejemplo entre dos adeninas.

4.1 Transformación de organismos

La recombinación genética es un proceso biológico que se produce normalmente en todos los organismos, tras el cual se produce un cambio del genoma (patrimonio genético del que está dotado un organismo) y se verifica normalmente con la rotura y la reunión del ADN. 

Hoy es posible crear moléculas recombinantes entre segmentos de ADN que no presentan homología y que pueden proceder de organismos diversos. Con el uso coordinado de las enzimas de restricción y de los vectores moleculares, es posible aislar una secuencia de ADN de cualquier organismo e inserirla en el ADN de otro. Las formas vivas que han sufrido tal transformación y que contienen un ADN extraño son llamadas transgénicas. Es quizás necesario abrir un paréntesis para aclarar el hecho de que la clonación de la oveja Dolly no se ha obtenido con técnicas de ingeniería genética. Dolly es solamente un gemelo idéntico, como los que se observan en la naturaleza, aunque estos últimos son "más" idénticos en cuanto que comparten también el material genético contenido en las mitocondrias.

Las técnicas de clonación que permiten obtener gemelos idénticos consisten en sustituir el núcleo de la célula madre por un núcleo de un donante del cual se quiere hacer una copia. La célula obtenida de este modo dará origen a un embrión cuyas mitocondrias contendrán el ADN de la célula madre y no el contenido en las mitocondrias del organismo del cual se ha querido hacer la copia. En caso de gemelos idénticos obtenidos naturalmente, los dos individuos comparten todo el patrimonio genético incluido el mitocondrial. Cerrado este paréntesis necesario para subrayar la diferencia entre ingeniería genética y clonación, en la que no se manipula el ADN y no se interviene en el orden genético de los organismos, pasamos a describir los vectores moleculares necesarios para las operaciones de ingeniería genética.


BIBLIOGRAFÍA 

http://www.ivu.org/spanish/trans/ssnv-genetic.html

UNIDAD IV: ADN RECOMBINANTE

3.5.2.3 Cryoconservación del germoplasma

La criopreservación o crioconservación de plantas es un proceso consistente en la preparación, mantenimiento y preservación a largo plazo de un material vegetal, en unas condiciones de temperatura ultra bajas de –196 ºC, obtenidas mediante nitrógeno líquido, suspendiendo así casi todos los procesos metabólicos de la planta.

El material vegetal a utilizar puede proceder de cualquier parte de la planta: semillas, meristemos, yemas, ápices, tallos, callos, embriones somáticos, etc. Debe ser seleccionado de plantas sanas, en el caso de proceder de material de cultivo in vitro, los parámetros de cultivo se deben optimizar antes de la crioconservación, ya que el éxito de éste proceso de conservación va a depender tanto de los tratamientos utilizados antes de someter al material al nitrógeno líquido, como de los utilizados una vez recuperado el material del mismo.

En general, conviene disminuir el contenido de agua del material vegetal para reducir los efectos de la formación de hielo en la congelación. Para ello el material se deshidrata parcialmente antes de la congelación. Esta deshidratación previa se puede realizar con sustancias como el gel de sílice o medios con altos contenidos en glicerol o sacarosa. Así, se elimina un gran porcentaje del agua contenida en el material, teniendo en cuenta que la mayoría de los materiales mantienen su viabilidad si conservan entre el 16,5 % y el 20 % del agua existente inicialmente en fresco [Uragami y cols., 1990, Plant Cell Reports 9:328-331], siendo la determinación de la tolerancia a la deshidratación y los métodos que permiten alcanzarla uno de los objetivos más importantes en el estudio de la crioconservación.

Por lo tanto, el método de congelación, la deshidratación y la utilización de sustancias crioprotectoras, de las que hablaremos más adelante, son los recursos existentes para reducir al máximo los daños que se pueden producir en la célula durante el proceso de congelación. De forma resumida, aunque al formarse el hielo, ya causa por sí mismo daños celulares, estos daños se agravan debido a que se produce el fenómeno de recristalización, que consiste en que los cristales de hielo que se forman en el interior celular durante el proceso de congelación, se derriten y vuelven a formarse dando lugar a estructuras termodinámicamente más estables, es decir, cristales más grandes, con un efecto sumamente dañino ya que provoca una extensa destrucción de estructuras protoplasmáticas y la lisis celular.

En el sistema de congelación lenta, el hielo comienza a formarse desde el exterior hacia el interior celular.

 El agua sale hacia el exterior desde el citoplasma y la vacuola, lo que provoca una diferencia de potencial osmótico que causa un aumento de la concentración de soluto en el interior celular, y esto va en detrimento de la posibilidad de supervivencia de la célula. Desarrollar este sistema requiere un equipo complejo y de gran coste que controle la disminución gradual y exacta de la temperatura y el tiempo de permanencia del material en cada estadio térmico programado en el protocolo. En el caso del sistema de congelación rápida ocurre lo contrario: se forma hielo desde el interior celular al exterior. El agua entra y la diferencia de potencial osmótico provocada es menor que en el método lento, por lo que los daños celulares que ocasiona una alta concentración de solutos no son tan críticos, si bien los daños por formación de hielo persisten.

Aunque los métodos de congelación son variados, curiosamente casi todos los autores coinciden en que el proceso de descongelación debe realizarse de forma rápida para evitar la recristalización, siendo el método más habitual la inmediata introducción del material congelado en agua caliente a 38 ºC.


BIBLIOGRAFIA 

http://www.encuentros.uma.es/encuentros98/crioconservacion.htm

http://www.buenastareas.com/ensayos/Criopreservacion-Germoplasma-Vegetal/1716342.html